南仏のアルビで生まれる。トゥールーズ=ロートレックの生家は、フランスの名家であり、伯爵家である。
トゥールーズ=ロートレックは、幼少期には「小さな宝石(プティ・ビジュー、仏: Petit Bijou)」と呼ばれて家中から可愛がられて育ったが、13歳の時に左の大腿骨を、14歳の時に右の大腿骨をそれぞれ骨折したために脚の発育が停止し、成人した時の身長は152cmに過ぎなかった。胴体の発育は正常だったが、脚の大きさだけは子供のままの状態であり、現代の医学者はこの症状を骨粗鬆症や骨形成不全症といった遺伝子疾患と考えている。脚の不自由だった彼は、しばしば疾走する馬の絵を描いている。
1882年にパリに出て、当初はレオン・ボナの画塾で学んだが、まもなくして画塾が閉鎖されたため、モンマルトルにあったフェルナン・コルモンの画塾に移り、以後は晩年まで同地で活動するようになった。なお、コルモンの画塾ではファン・ゴッホ、エミール・ベルナールらと出会っている。
絵画モデルであった、マリー=クレマンチーヌ・ヴァラドン(後のシュザンヌ・ヴァラドン)のデッサンの才能を高く評価し、彼女が画家となるきっかけを作った。彼女をシュザンヌと呼び始めたのもトゥールーズ=ロートレックである。
画家自身が身体障害者として差別を受けていたこともあってか、娼婦、踊り子のような夜の世界の女たちに共感。パリの「ムーラン・ルージュ(赤い風車、仏: Moulin Rouge)」をはじめとしたダンスホール、酒場などに入り浸り、デカダンな生活を送った。そして、彼女らを愛情のこもった筆致で描いた。作品には「ムーラン・ルージュ」などのポスターの名作も多く、ポスターを芸術の域にまで高めた功績でも美術史上に特筆されるべき画家であり、「小さき男(プティ・トム、仏: Petit Homme)、偉大なる芸術家(グラン・タルティスト、仏: Grand Artiste)」と形容される。
アブサンなどの長年の飲酒により体を壊した上、梅毒も患ってトゥールーズ=ロートレックは次第に衰弱していった。サナトリウムに短期間滞在した後の1901年8月20日にパリを発って母のもとへ行き、同年9月9日、自邸のマルロメ城で母に看取られ脳出血で死去した。36歳。城の近くのヴェルドレに埋葬された。
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